用 Suc-Ala-Ala-Ala-pNA作為底物進(jìn)行測(cè)定

所需材料

1.      Tris緩沖液；0.1 M Tris pH 8.3，25°C。將 6.75 g Tris-HCl 和 8.14 G Tris 堿溶解在 900 ml H ₂ O 中。在 25°C 下測(cè)定 pH 值。如有必要，用 0.1 M HCl 或 0.1 M NaOH 滴定至 pH 8.3。用 H ₂ O稀釋至 1000 ml。
 

2.      NaOAc-NaCl緩沖液；0.05 M NaOAc pH 5，含有 0.1 M NaCl。將 14.8 ml 0.2 M HAc 和 35.2 ml 0.2 M NaOAc 以及 100 ml 0.2 M NaCl 混合。用 H ₂ O 定容至 200 ml。在 25°C 下滴定至 pH 5。
 

3.      底物溶液；0.1 M Tris pH 8.3 中為 2.5 mM。使用 25 mg 小瓶 N-Suc-Ala-Ala-Ala-pNA（EPC 編號(hào) NS945），用 22 ml tris 緩沖液溶解內(nèi)容物。（注：使用約 10 ml 緩沖液沖洗底物瓶 5 次。）攪拌溶解。儲(chǔ)存于 5°C。
 

4.      彈性蛋白酶溶液；將 1.0 mg/ml 溶解在 NaOAc-NaCl 緩沖液中。在相同的緩沖液中制備每毫升 0.10 毫克的二級(jí)溶液。將兩種溶液置于冰浴中保持低溫。
 

程序

1.      將分光光度計(jì)調(diào)節(jié)至 410 nm，池溫度調(diào)節(jié)至 25°C。
 

2.      將池中 2.5 ml Tris 緩沖液和 0.5 ml 底物溶液平衡至 25°。
 

3.      添加 0.005 ml 0.10 mg ml 彈性蛋白酶溶液，混合并以 1 分鐘為間隔測(cè)定吸收率的增加率。利率增幅應(yīng)約為。0.025 – 0.040 Δ ₄₁₀  nm 每分鐘。

比活度的計(jì)算

?, 1%, 280 = 19.5 對(duì)于豬胰腺彈性蛋白酶

毫克/毫升 = A ₂₈₀  x 0.51

體積 = 3.005 ml A=410 nm T=25°C 光程=1.0 cm

8.8=pNA在410 nm處的mM消光系數(shù) 

單位  =   ΔA ₄₁₀  x 3.005 毫升
毫克 8.8 x 0.0005 毫克

品牌  ELASTIN PRODUCTS COMPANY

豬胰腺彈性蛋白酶多克隆抗體，編號(hào) PR121

抗原：豬胰腺彈性蛋白酶，（EPC 號(hào) EC134）

從用純化的豬胰腺彈性蛋白酶（EPC No. EC134）免疫的兔子獲得的全血清。